复旦大学中山医院上海市心血管病研究所
邹云增，马宏

前言

    干细胞在器官发育和组织修复中占有非常重要的地位，是一支天然的防御力量。在我们人体中，许多组织和器官都有着惊人的再生能力。小肠绒毛上皮全部更新一次只需要2-5天；表皮组织维持着周期为2周的自我更新速度；而肝脏组织切除75%后，经过4-6个月左右就可以恢复原来大小…… 然而，心肌组织的再生能力极其有限，甚至曾一度认为不具有再生能力，一旦心肌组织大量死亡，将不可逆转地进入心力衰竭阶段，我们现有的治疗手段仅仅是延缓心衰的发展过程。因此，心血管研究领域一个持续而活跃的主题就是寻找一种细胞类型，它具有心肌细胞样的功能，并能够通过移植在受损的心肌组织处发挥作用，干细胞以其独特的增殖和分化能力成为这一领域的焦点。

    骨骼肌成肌细胞是研究者们最先考虑用于心肌再生的候选细胞种类之一，早在1993年美国印第安纳大学医学院的Loren J. Field教授就通过实验发现移植入小鼠心脏的骨骼肌成肌细胞可以长期存活并具有收缩功能，并在《JCI》上发表了实验结果。

    1996年美国印第安纳大学医学院的Loren J. Field 教授在《JCI》上发表文章，发现将胚胎干细胞（ESC）分化的心肌样细胞移植入动物体内可以继续存活并与宿主心肌组织整合，提示ESC细胞在治疗心血管疾病中具有可行性。2001 年美国纽约医学院的Piero Anversa 教授在《Nature》上发表论文，首先在动物实验中发现在心梗后的心肌中移植骨髓细胞可以重塑心肌，改善心功能。由此，越来越多的研究投入到成体干细胞治疗心血管疾病的领域。2006年日本的Shinya Yamanaka教授首先在《Cell》上发表诱导多能干细胞（iPS）的建立方法，由此干细胞领域掀起了新一轮研究热潮，而如何高效地将iPS细胞转化为心肌细胞并应用到心肌再生中还有很多问题需要我们解决。

干细胞的治疗和应用潜力

    本实验室的研究结果也显示了骨髓干细胞治疗心血管疾病的应用潜力，也发现骨髓干细胞中造血干细胞并不能修复梗死心脏，因此如何纯化骨髓干细胞中的有效成分，是决定干细胞治疗效果的先决条件。

    尽管上述研究结果令人兴奋，但是干细胞治疗心血管疾病还有很多困难需要克服。如何选择合适的细胞分子标志来筛选有效的干细胞进行治疗？如何使细胞的体外扩增更加有效并具有临床应用的价值？如何利用无毒性的诱导剂建立高效的心肌分化体系？是否能够建立异体移植用的细胞库，如何处理免疫原性的问题？……今后将会更加以临床为导向进行研究，希望终有一天干细胞治疗为人们的健康作出更大的贡献。

心脏干细胞的研究历史

    一直以来，心脏被认为是一个终末分化的器官，心肌细胞不具有增殖和分裂能力，一旦受到损伤将造成心肌组织不可逆的丧失。然而，这种观点受到越来越多的质疑，研究者发现心肌组织处在一种低水平的增殖状态，并通过不同的标志物分离出各种心脏成体干细胞。

    （1）通过消化心脏组织得到的细胞，经过不断培养筛选也可以得到能够形成克隆，并且具有心肌分化能力的心脏干细胞。

    （2）心肌组织中Sca-1(+)细胞并不具有心肌标志，但是经过诱导可以分化为心肌细胞，并且在移植到宿主心脏后仍然具有这种特性，而且可以与宿主的心肌组织整合成协调的整体。

    （3）c-kit(+)细胞是另一群从心肌组织中分离出来的心脏干细胞，它们形态幼稚，能够传代和扩增，并向心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞分化，当移植进受损心脏组织后可以分化成心肌组织，并与其他心肌细胞形成细胞连接。

    （4）Isl-1 与胚胎时期心脏发育相关，后来发现在成年心脏中存在Isl-1(+)细胞，这种细胞具有心脏干细胞的特性。

    （5）2008年William T. Pu 小组研究发现在成体心脏外膜下存在Wt1(+)细胞，它在心脏发育中可以分化成为具有功能的心肌细胞，进一步的实验提示，它来源于Nkx2.5 和Isl1阳性的多能前体细胞，成为心脏再生治疗里又一新的候选成员。

    （6）心脏侧群细胞（cSP）侧群细胞（side population， SP）是一种特殊类型的干/祖细胞，最初是Margaret A. Goodell等研究者1996年在分离纯化小鼠骨髓造血干细胞时被分离和鉴定的，其发育和分化状态可能介于胚胎和成体干细胞之间，仍具有很强的多向分化潜能和增殖特性，能参与相应组织的更新与再生。由于它具有将荧光染料Hoechst 33342泵出细胞外的特性，利用这一特性并结合荧光激活细胞分选法(fluorescence-activated cell sorting， FACS)可对其进行分离纯化，在流式二维分析点阵图上，呈彗星状分布在造血干/祖细胞主群的一侧，因此被称为侧群(side population， SP)细胞或侧群干细胞。随后证实其广泛存在于人以及多种哺乳动物的许多重要组织器官，如肝、肾、脑等。

    自2002 年不断有证据表明，心脏中也含有SP 细胞，它们具有干细胞特性，表达一些干细胞的标志，如Sca-1，mdr1，c-kit 等。cSP 细胞具有心脏干细胞的特点，能够增殖形成克隆并分化为心肌细胞、内皮细胞、脂肪组织等多种细胞类型，既为心脏自我修复提供了理论依据，又提供了一种新的治疗用细胞。

    心脏SP 细胞分布在心脏组织中，生理状态下维持极低水平的增殖更新，发生心肌梗死后，SP 细胞的增殖水平提高，并有一部分来自循环中的SP 细胞驻留心脏，转化为心脏SP细胞。

    虽然实验重现了上述病理生理过程，但是在自然发生的心梗病例中，心梗区疤痕的形成不可避免。那么，究竟是SP 细胞更新水平不够，化学趋化动力不足，还是缺乏分化的诱导条件而导致心梗的不可逆？这些问题都有待进一步的研究。此外，cSP 被认为是一群异质性细胞的集合，可能包含了心肌细胞、内皮细胞等的祖细胞、前体细胞，甚至更加原始的细胞类型，所以对cSP 细胞亚群的分析也需要进一步深入。

    而从治疗的角度出发，相较利用各种抗体分选的到的心脏干细胞，cSP 细胞的分离更加便捷廉价；在没有明确的心脏干细胞标志谱系的情况下，通过研究这个群体的各种反应，对心脏再生的研究也具有不可替代的意义。

    本实验室的cSP 近年来也开展了心脏干细胞的研究。利用FCM 分选cSP 细胞，并观察到其在特殊培养条件下出现集落样生长现象。cSP 和cMP 一样，都具有生长因子受体，与生长因子具有浓度依赖。同时，也观察了cSP 向心肌细胞，平滑肌细胞，内皮细胞的分化（ETS1的表达），并优化了分化条件；也发现，cSP 经过传代培养后仍然具有分化潜力，通过不同的诱导条件，达到最优化的促分化效果。经过Dil标记的cSP 细胞移植后，在心梗动物模型中发现标记过的cSP 细胞，并进行了移植后的随访观察（分别是移植术后5天、4周的情况）。初步结果显示了cSP 细胞的潜力。

心脏干细胞应用展望

    心脏干细胞在心脏再生医学中的地位应该被重新认识。2008年Jan Kajstura研究小组发现激活心脏干细胞可以部分地修复受损的心脏组织，并降低死亡率。并且，这种修复能力可以比拟细胞移植治疗后的效果。尽管目前来看心脏干细胞并不能直接用于临床治疗，但是，它为心脏再生治疗指出了一片新的研究领域，对深入研究干细胞分子机制也具有重要的促进作用。